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細胞凍存和復(fù)蘇

更新時間:2019-03-07 點擊次數(shù):1980
 細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”,這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多用二甲基亞砜(DMSO)作為保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性;緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復(fù)蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
 
細胞凍存操作要點:
 
1、細胞凍存前12~24h,換新鮮培養(yǎng)基,使細胞一直處于對數(shù)生長期。
 
2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化,用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液,1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。
 
3、棄上清,加入凍存液重懸細胞沉淀,調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內(nèi),每管1~1.5mL,擰緊蓋子。在管壁上做好標記,標明細胞名稱、凍存日期等。(細胞凍存液配方可為胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=4:5:1或胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=1:8:1或胎牛血清:DMSO=9:1,可根據(jù)各實驗室實際條件調(diào)整)
 
4、按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便,細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃過夜,再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于低刻度線;凍存5次后異丙醇需要跟換一次,以免影響凍存效果。
 
5、細胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存,為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),觀察細胞生長情況,再繼續(xù)凍存。
 
 
細胞復(fù)蘇操作要點:
 
1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱;準備一個15mL無菌的離心管,加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
 
2、將凍存細胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫(可準備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中)。輕輕晃動凍存管,使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍,使細胞能盡快通過易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,避免引起污染。
 
3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi),將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi),輕輕吹打液體,使細胞均勻分散,降低DMSO濃度,吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
 
4、800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,吹打制成細胞懸液。
 
5、將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi),補加適量的培養(yǎng)基,輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
 
6、第二天觀察細胞貼壁生長情況,換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代,細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。
 
對DMSO不敏感的細胞在復(fù)蘇時也可不離心,減少操作步驟,也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi),補加新鮮培養(yǎng)基,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基,移除死細胞。

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