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如何用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞?

更新時(shí)間:2021-05-19 點(diǎn)擊次數(shù):1362
   淋巴細(xì)胞分離液可用于體外分離外周淋巴血細(xì)胞,也可以從其他來(lái)源中分離單核細(xì)胞,包括臍帶血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞,適用于從血液及組織勻漿中分離所需細(xì)胞,在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物中廣泛應(yīng)用。其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液。
  如何用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞?
  1)分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞
  1.抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的無(wú)血清緩沖液懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上,室溫中,水平離心500×g 20分鐘。此時(shí)離心管中形成5層:最上面是血漿,血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間是PBMC,淋巴細(xì)胞分離液層和最下面的紅細(xì)胞層之間是粒細(xì)胞層,又成為棕黃層。
  2.吸去最上層的血漿,收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞,盡量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液(洗滌液),混勻后離心200×g 10分鐘,低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板,去上清液。
  3.再用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次,每次離心500×g 10分鐘,洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液。用1%臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力(應(yīng)>95%)并計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。
  2)分離關(guān)節(jié)滑液中的單個(gè)核細(xì)胞
  1.將關(guān)節(jié)滑液置含肝素(終濃度5IU/ml)的離心管中,離心1000×g 15分鐘。
  2.用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮沉淀細(xì)胞并洗滌細(xì)胞1次,每次離心1000×g 15分鐘。用含2%滅活小牛血清的Hanks液懸浮細(xì)胞至原容量。
  3.用淋巴細(xì)胞分離液分離關(guān)節(jié)滑液中的單個(gè)核細(xì)胞,并用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。
  3)分離組織中的單個(gè)核細(xì)胞
  1.取外科分離的各種組織,用含1%慶大霉素和1%小牛血清的MEM培養(yǎng)液洗滌組織塊,洗去可能的污染物。將組織塊置培養(yǎng)皿中,加入約為組織塊體積5~10倍的同樣MEM培養(yǎng)液。用無(wú)菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm3大小。
  2.將組織塊轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)瓶中,靜置片刻,吸去培養(yǎng)液。加入約2倍組織塊體積的、濾過(guò)除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1~2小時(shí),注意組織塊的消化程度。
  3.當(dāng)組織塊消化分散后,用手用力搖晃培養(yǎng)瓶3~5分鐘或用大口吸管反復(fù)吹打,使細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分散。加入30ml上述MEM培養(yǎng)液,終止酶反應(yīng)。
  4.讓上述懸液通過(guò)200目的金屬網(wǎng)或尼龍網(wǎng),分離單個(gè)細(xì)胞。用上述MEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,每次離心1000×g 10分鐘。用1%臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)數(shù)細(xì)胞。
  5.如果細(xì)胞量較多(>107),應(yīng)當(dāng)用上述淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,并用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。
  4)從小鼠胸腺中分離胸腺細(xì)胞
  1.脫臼或剪頭處死小鼠,置75%乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定,剪開(kāi)小鼠胸腔,暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗凈血液,去除結(jié)締組織。
  2.在有少量細(xì)胞培養(yǎng)液的平皿中,用鑷子梳理胸腺,再用大口吸管反復(fù)吹打,分離單個(gè)細(xì)胞。離心沉淀細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次。加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液,靜置5分鐘,讓大的組織塊自然沉降,吸出單個(gè)胸腺細(xì)胞。
  3.用1%臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力,計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。

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