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造血干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)步驟及注意事項
點擊次數(shù):1646 更新時間:2014-03-28
造血干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)步驟
1、胚胎成纖維細胞的復蘇:胚胎干細胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下,生長在鋪有一層滋養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)皿或者是細胞培養(yǎng)瓶中(此處以細胞培養(yǎng)皿為例)。因此要先鋪滋養(yǎng)層細胞。在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細胞。把融化的細胞懸浮液加到裝有幾毫升預熱好的MEF培養(yǎng)基的無菌離心管中,輕輕混勻后,1000×g ,5min離心收集細胞。吸掉上清(除去凍存液中的DMSO),用10ml預熱的MEF培養(yǎng)基重懸細胞后,加到一個10cm的細胞培養(yǎng)皿中,放入37℃,含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)情況對細胞進行換液,大約4天左右,細胞就可以基本長滿整個培養(yǎng)皿,這時可以進行傳代、凍存或用于制備滋養(yǎng)細胞層。
2、滋養(yǎng)細胞層的制備:把長好的小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)基吸掉,加入10ml新鮮的MEF培養(yǎng)基,并在避光的條件下加入110μl配好的絲裂霉素C,混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。把含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存,在一周之內(nèi)可再次使用(直接使用該培養(yǎng)基處理細胞5h)。用PBS(不含二價離子)洗滌細胞2到3次后,用1ml含有EDTA的胰酶消化細胞,37℃培養(yǎng)箱放置約3min,直到細胞懸浮起來。用1ml MEF培養(yǎng)基中和胰酶的作用,之后把細胞收集到離心管里,1000×g離心5min。去掉上清,用1ml MEF培養(yǎng)基重懸細胞,之后把細胞平均分到兩個經(jīng)過0.1%明膠處理過的細胞培養(yǎng)皿
中,用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。(明膠處理:加5ml 0.1%的明膠到細胞培養(yǎng)皿中,在37℃培養(yǎng)箱中至少放置10min,之后把明膠吸掉即可)。一般處理好的小鼠胚胎成纖維細胞在1~2h之后即可以貼壁,形成滋養(yǎng)細胞層,這時的滋養(yǎng)細胞層即可
用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞。制備好的滋養(yǎng)細胞層可以在MEF培養(yǎng)基中保持1周左右的時間,或者是把細胞凍存。
3、小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells,ES cells)的復蘇
4、小鼠胚胎干細胞的傳代
5、小鼠胚胎干細胞的凍存
造血干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)注意事項:
1、絲裂霉素C在操作時要避光,避免其分解。
2、ES細胞傾向于聚集生長,因此在復蘇時,要選擇好培養(yǎng)皿的規(guī)格
3、ES細胞不能長的太滿,應避免使各個克隆之間接觸,以免發(fā)上分化。
4、為避免水或血清帶來的污染,對血清應進行支原體檢測,配好的培養(yǎng)基要進行污染測試。
座機:
023-63419609
聯(lián)系方式:
15021010459
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